우간다 북부에서 dihydroartemisinin과 lumefantrine에 대한 Plasmodium falciparum의 감수성 감소

Nature Communications 13권, 기사 번호: 6353(2022) 이 기사 인용

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Artemisinin 부분 저항성은 병용 요법 파트너 약물에 저항하는 Plasmodium falciparum의 선택을 용이하게 할 수 있습니다. 우리는 저항성 PfK13 C469Y 및 A675V 돌연변이가 나타난 우간다 북부와 이러한 돌연변이가 흔하지 않은 우간다 동부에서 2021년에 수집된 99개의 P. falciparum 분리주를 평가했습니다. 생체외 링 생존 분석을 통해 469Y 돌연변이(돌연변이의 경우 평균 생존율 7.3%, 혼합형의 경우 2.5%, 야생형의 경우 1.4%) 및/또는 Pfcoronin 또는 falcipain-2a의 돌연변이가 있는 분리주는 생존율이 상당히 높았습니다. 생존율이 5%를 초과하는 모든 분리물은 이들 단백질 중 적어도 하나에 돌연변이가 있었습니다. 생체 외 성장 억제 분석을 통해 북부 대 동부 우간다에서 루메판트린(중앙값 IC50 14.6 대 6.9 nM, p < 0.0001) 및 디히드로아르테미시닌(2.3 대 1.5 nM, p = 0.003)에 대한 감수성이 감소했습니다. 14/49 북부 대 0/38 동부 분리주는 루메판트린 IC50 > 20 nM(p = 0.0002)을 나타냈습니다. 2015년부터 2021년까지 분리된 819개 균주에 대한 표적 서열 분석을 통해 약물 감수성 변경과 관련된 다중 다형성, 특히 루메판트린에 대한 감수성이 감소된 PfK13 469Y(p = 6 × 10−8) 및 클로로퀸 내성이 있는 PfCRT 돌연변이(p = 1 × 10−20)가 확인되었습니다. . 우리의 결과는 우간다의 1차 항말라리아제인 artemether-lumefantrine의 활동에 대한 우려를 불러일으킵니다.

약물 내성으로 인해 수십 년 동안 열대열 말라리아의 치료와 통제가 어려워졌습니다1. 현재 말라리아 치료에 사용되는 가장 중요한 약물인 아르테미시닌에 대한 부분 내성은 약 15년 전에 동남아시아에서 확인되었습니다2,3. 부분 저항성 표현형은 아르테미시닌 치료 후 기생충 제거가 지연되거나4, 디히드로아르테미시닌(DHA)5에 노출된 후 배양된 기생충의 생존율이 향상되는 것을 의미합니다. 동남아시아의 부분 저항성은 P. falciparum kelch 13(PfK13) 단백질의 프로펠러 도메인에서 약 20개의 후보 또는 검증된 돌연변이와 관련이 있는 것으로 나타났습니다6,7. 추가적인 다형성은 아르테미시닌 내성 동남아시아 기생충에서 PfK13 돌연변이를 동반했으며,8,9 DHA가 있는 아프리카 기생충의 시험관 내 선택은 P. falciparum coronin(Pfcoronin)10의 돌연변이와 관련된 제거를 지연시켰습니다. 동남아시아에서 저항 매개자로 검증된 PfK13 돌연변이는 세계의 다른 일부 지역에서도 보고되었지만11,12,13, 그러나 최근까지 이러한 돌연변이의 지속적인 유병률이나 문서화된 임상적 또는 시험관 내 저항성에 대한 증거가 부족했습니다14. 가장 큰 우려 사항은 말라리아 발병률과 사망률이 가장 높은 아프리카에서 잠재적인 저항성 출현 또는 확산이었습니다15. 최근, 이전에 아시아에서 아르테미시닌 부분 저항성과 연관되었던 PfK13 돌연변이가 동아프리카에서 기술되었으며, 르완다에서는 PfK13 R561H 돌연변이가 나타나고16,17,18 북부 우간다에서는 C469Y 및 A675V 돌연변이가 나타났습니다19,20,21,22. 제한된 연구에서 C469Y, R561H 및 A675V 돌연변이는 임상적으로 측정된(지연된 제거) 또는 시험관 내에서(향상된 생존)17,22 아르테미시닌 부분 저항성과 연관되어 있는 것으로 나타났습니다. 그러나 최근에 등장한 P. falciparum의 영향에 대한 우리의 이해는 아프리카에서 선도적인 아르테미시닌 기반 병용 요법(ACT)의 약물 민감성과 치료 효능에 대한 돌연변이는 불완전합니다.

ACT는 빠르게 작용하는 아르테미시닌과 느리게 작용하는 파트너 약물을 결합합니다23. 동남아시아에서는 아르테미시닌 부분 저항성의 출현 이후 ACT 파트너 약물인 메플로퀸24 및 피페라퀸25의 항말라리아 활성 감소에 대한 증거가 나타났습니다. 특히, 주로 PfK13 580Y 돌연변이와 관련된 아르테미시닌과 PfCRT의 새로운 돌연변이 및 플라스멥신 2/3 유전자 증폭과 관련된 피페라퀸에 대한 내성으로 인해 캄보디아에서 DHA-피페라퀸의 실패율이 50%를 초과했습니다26,27,28. 최근 동아프리카에서 아르테미시닌에 대한 부분 저항성의 출현은 유사하게 ACT 파트너 약물에 대한 민감도가 감소된 기생충의 선택으로 이어질 수 있습니다. 아프리카의 막대한 말라리아 피해를 고려할 때, 이러한 결과는 1980년대 클로로퀸 내성의 출현에서 볼 수 있듯이 파괴적일 수 있으며 이는 수백만 명의 과도한 말라리아 사망자를 초래합니다29.

20 nM (p = 0.0002; Fig. 2). RSAs, which entailed counting parasites 72 h after initiation of a 6 h DHA pulse, did not show significant differences in survival between isolates from northern (median 2.5% survival for 52 samples) and eastern (median 1.4% survival for 29 samples; p = 0.53) Uganda, but of note some parasites with PfK13 mutations associated with delayed parasite clearance were present at both sites (Fig. 2)./p>5% had either the PfK13 469Y mutation, mutations in falcipain-2a, or both. Interestingly, mutations in PfK13 outside the propeller domain were associated with decreased RSA survival (the opposite of the effect of PfK13 469Y); considering any of 15 non-propeller mutations identified, survival was 1.5% in 42 mutant vs. 5.5% in 26 fully wild type isolates (p = 0.02; Supplementary Table 2). Two other polymorphisms with significant independent associations were deletion in a putative ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 1, associated with increased RSA survival, and a SNP in a gene encoding a protein of unknown function, associated with decreased survival./p>30 nM (median IC50 39.5 nM), subsequent IC50 values measured after culture for 4 or more weeks and then after freezing, thawing, growth in culture, and repeat assays, were generally lower than the initial ex vivo values (Table 5). However, after culture adaptation IC50 values for these eight northern Uganda isolates measured before (median IC50 13.2 nM) or after (median IC50 16.9 nM assessed in Uganda and 7.4 nM assessed in the USA) freeze-thaw-reculture were above values for parasites collected from eastern Uganda for direct comparison with the northern Uganda isolates (median IC50 6.9 nM for 38 isolates) or for a larger set of isolates published earlier (median IC50 5.1 nM for 365 isolates32)./p>5% despite lack of the PfK13 469Y mutation had mutations in falcipain-2a. Of the 17 mutations identified in falcipain-2a, 11 were also identified in isolates from southeast Asia in which falcipain-2a haplotypes were associated with enhanced RSA survival9. Falcipain-2a is a hemoglobinase that plays a key role, in concert with other proteases, in hydrolyzing hemoglobin to supply amino acids for parasite metabolism43. Loss of falcipain activity due to treatment with specific inhibitors or gene knockout markedly blunted the antimalarial activity of DHA, indicating that falcipain-mediated proteolysis of hemoglobin is needed for efficient activation of artemisinins44. These results are consistent with our understanding that the conversion of artemisinins by heme, after liberation from hemoglobin, into toxic free radicals, is a prerequisite to efficient action of artemisinins45. Interestingly, a mutation encoding a falcipain-2a stop codon was identified in parasites selected in vitro for resistance to artemisinin, but this selection occurred after emergence of a PfK13 mutation6. Taken together, available data suggest that certain mutations in falcipain-2a can mediate artemisinin partial resistance independent of or in concert with mutations in PfK13./p>1% parasitemia were diluted to 1%; isolates with ≤1% parasitemia were cultured at starting parasitemias. The cells were washed to remove drug after 6 h, and culture was continued for an additional 66 h. At 72 h after culture initiation, Giemsa-stained thin smears were prepared. Cultures were considered viable and appropriate for assessment if control parasitemia was ≥0.2% and also ≥25% of the starting parasitemia. Parasitemias were counted in control and treated cultures, and RSA survival was expressed as the proportion of viable parasites in the DHA treated cultures relative to controls./p>15%) prevalence of minor alleles were evaluated independently, as described above, and loci with low (≤15%) minor allele prevalence were analyzed as aggregate variables, in which the presence of any minor allele was compared with the major allele. For both high and low prevalence loci, p ≤ 0.05 were considered significant. For loci that were statistically significant, RSA survival was also evaluated in the context of K13 C469Y and A675V mutations. Candidate loci and K13 genotypes were treated as binary variables as described above./p>