TadA 변종에서 생성된 향상된 시토신 기본 편집기

Nature Biotechnology 41권, 686~697페이지(2023)이 기사 인용

12,000회 액세스

4 인용

50 알트메트릭

측정항목 세부정보

사이토신 염기 편집기(CBE)는 프로그래밍 가능한 게놈 C·G에서 T·A로의 전이 돌연변이를 가능하게 하며 일반적으로 변형된 CRISPR-Cas 효소, 자연 발생 시티딘 데아미나제 및 우라실 복구 억제제로 구성됩니다. 이전 연구에서는 자연적으로 발생하는 시티딘 탈아미노효소를 활용하는 CBE가 유도되지 않은 게놈 전체의 시토신 탈아미노화를 유발할 수 있음을 보여주었습니다. 확률론적 게놈 전체의 표적 이탈을 감소시키는 개선된 CBE가 이후에 보고되었지만, 이러한 편집자는 차선의 표적 성능으로 어려움을 겪을 수 있습니다. 여기에서 우리는 다양한 서열의 게놈 유전자좌 세트에 걸쳐 높은 표적 C·G에서 T·A를 가능하게 하는 TadA(CBE-T)의 조작된 변이체를 사용하는 CBE의 생성 및 특성화를 보고하고 일차 세포에서 강력한 활동을 보여줍니다. 게놈 차원의 돌연변이에서 감지 가능한 상승을 유발하지 않습니다. 또한 A-I 및 C-U 편집(CABE-T)을 모두 촉매하는 시토신 및 아데닌 염기 편집기(CABE)를 보고합니다. ABE와 함께 CBE-T 및 CABE-T는 이전에 보고된 CBE에 비해 향상된 특성을 가진 실험실에서 진화된 TadA 변이체를 사용하여 모든 전이 돌연변이의 프로그래밍 가능한 설치를 가능하게 합니다.

시토신 염기 편집자(CBE)는 살아있는 세포의 게놈 DNA에 C·G에서 T·A 염기쌍 변화를 프로그래밍 방식으로 도입할 수 있는 유전자 편집 효소입니다. 이러한 화학적 전환은 효소 매개 시토신의 가수분해 탈아미노화를 통해 이루어지며, 이는 DNA 중합효소에 의해 티민으로 해석됩니다1. 현재까지 CBE는 일반적으로 자연 발생 시티딘 데아미나제(예: APOBEC, AID 또는 CDA)2, 염기 편집되지 않은 DNA 가닥에 흠집을 낼 수 있는 손상된 형태의 Cas9, 하나 이상의 단위 등 네 가지 별개의 구성 요소로 구성됩니다. 우라실 글리코실라제 억제제(UGI) 펩타이드와 핵 국소화 서열(NLS)1,2,3. 이러한 구성 요소는 일반적으로 공유적으로 융합되지만 비공유적으로 조립될 수도 있습니다4. CBE는 유전자 복귀 및 세포 공학에 널리 활용되어 왔으며 쇠약해지는 유전 질환 또는 악성 종양을 앓고 있는 환자에게 치료상의 이점을 제공할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다5.

현재 CBE 기본 편집 도구를 사용하면 높은 표적 DNA 편집 효율성을 달성할 수 있지만2 게놈 전반에 걸쳐 확률론적 가이드 RNA(gRNA) 독립적인 표적외 편집이 발생할 수도 있습니다6,7. YE1(참고 8), BE4-PpAPOBEC9 및 기타10와 같은 차세대 CBE 편집기는 gRNA 독립적인 오프 타겟 결과를 완화하는 것으로 보고되었지만 이러한 편집기는 APOBEC 데아미나제의 천연 또는 가볍게 조작된 변이체를 사용하며 감소로 어려움을 겪을 수 있습니다. -대상 편집 성능2,9. 또한 일부 서열 특정 상황에서 APOBEC 기반 CBE는 APOBEC의 비효율적이지만 측정 가능한 이중 가닥 DNA(dsDNA)를 기질로 수용하는 능력으로 인해 표적 게놈 서열에 인접한 근위 편집으로 이어질 수 있습니다.

아데닌 염기 편집기(ABE)는 아데닌을 이노신으로 화학적으로 전환시키는 실험실에서 진화된 TadA 데아미나제를 통해 표적 유전자좌에 A·T에서 G·C 점 돌연변이를 프로그래밍 방식으로 설치하는 유전자 편집 효소입니다12. DNA 중합효소의 활성 부위 내에서 시토신과 이노신 염기쌍이 결합되어 DNA 복제 후 이노신에서 구아닌으로의 돌연변이가 발생합니다. 특히, ABE는 gRNA 독립적인 오프 타겟을 낮거나 전혀 일으키지 않고 보다 정확한 창(위치 ~3-8, PAM 21-23) 내에서 게놈 DNA(gDNA)를 편집하므로 가이드 의존적 오프 타겟이 더 적어질 수 있습니다. CBE6,13에 비해 주변인 편집이 적습니다. 또한 ABE는 dsDNA에 작용하는 것으로 보고되지 않았습니다.

CBE에 ABE의 유리한 특성을 부여하기 위해 우리는 TadA를 강력한 시티딘 탈아미노화를 수행할 수 있는 효소로 변환하고 이후 자연 발생 시티딘 탈아미노효소 대신 TadA를 사용하는 향상된 클래스의 CBE를 생성하는 것을 구상했습니다. 고무적으로, 이전 조사에서는 UGI14를 포함하여 낮지만 감지 가능한 C에서 T 편집에 대한 ABE의 가단성을 입증했습니다. 실제로 구조 기반 설계를 통해 ABE7.10에 비해 향상된 시토신 활성을 가능하게 하지만 높은 TC 서열 특이성을 갖는 ABE 변종인 ABE-P48R-UGI가 보고되었습니다. 이러한 발전은 우리의 목표를 향한 진전을 의미하지만, 높은 제품 순도와 기질 서열 제한 없이 치료적으로 관련된 C·G-to-T·A 편집 효율성을 달성하려면 TadA의 추가 엔지니어링 및 진화가 필요하다는 것을 인식했습니다.

25-fold C·G to T·A editing increase over ABE8.20-m at genomic sites tested (Fig. 1f and Supplementary Figs. 2–4)./p> 0.05; one-sided Mann–Whitney U test). In contrast, BE4 caused a mean fold-enrichment of 3.8 times for C·G to T·A edits over control (P = 7.770e−05; one-sided Mann−Whitney U test) and BE4-PpAPOBEC caused 1.5 times the mean fold-enrichment of C·G to T·A (P = 0.00147; one-sided Mann−Whitney U test) (Fig. 5a)6,13. CABE-Ts and CBE-Ts also did not cause a significant elevation in genomic A·T to G·C SNVs (all P > 0.05; one-sided Mann−Whitney U test) (Fig. 5b) and stochastic deamination genome-wide was indistinguishable from untreated cells./p>

0.8% C-to-T editing was detected for any editor are included. Values were determined from transfection of HEK293T with mRNA encoding editors or controls at saturating conditions, with n = 4 independent biological replicates performed on different days./p>